Avaliação de marcadores de prognóstico no câncer de mama e análise funcional de CIP4 / Evaluation of prognostic markers in breast cancer and functional analysis of CIP4

O câncer de mama é uma doença extremamente heterogênea compreendendo diferentes subtipos moleculares que resultam em evoluções clínicas e condutas terapêuticas distintas. A maior gravidade desta patologia está associada a sua capacidade de formação de metástases Mudanças no padrão de expressão gênica têm sido associadas à manifestação do fenótipo metastático. Neste trabalho, utilizamos microarranjos de tecido (TMAs) para investigar a expressão de 8 biomarcadores candidatos (CIP4, PPIL1, ITGAV, AKAP14, MICA, FXYD1, ARPC3, ABG1) e avaliar seu potencial prognóstico em pacientes com carcinoma ductal invasivo da mama. Destes, ARPC3 PPIL1 e CIP4 mostraram associações estatisticamente significativas com a sobrevida câncer específica e/ou a probabilidade de desenvolvimento de metástases. Determinamos que a expressão aumentada de CIP4 nos tumores está associada a maior probabilidade de desenvolvimento de metástases. CIP4 é uma proteína adaptadora descrita na literatura como moduladora de migração e invasão celular e portanto selecionamos este candidato para caracterização funcional detalhada. Observamos que a expressão de CIP4 encontra-se aumentada em linhagens tumorais com características invasivas. A partir do silenciamento estável e regulado de CIP4 na linhagem metastática MDA-MB-231, determinamos que CIP4 modula positivamente a ativação de MAPK-p38 e a expressão de MMP2 , sugerindo que CIP4 participe em vias de sinalização importantes para a transição epitélio-mesenquima (EMT). O silenciamento de CIP4 resultou em uma redução de aproximadamente 50% da capacidade migratória e invasiva das células tumorais in vitro , e na diminuição da formação de metástases pulmonares in vivo. Coletivamente, nossos resultados indicam que CIP4 tem potencial como marcador de prognóstico assim como um possível alvo terapêutico no controle da disseminação de metástases nos tumores da mama

Breast cancer is an extremely heterogeneous disease comprising different molecular subtypes that result in different clinical outcomes and therapeutic procedures. The severity of this disease is mainly associated with its ability to produce metastasis. Changes in gene expression profile have been associated with the manifestation of the metastatic phenotype. In this study, we used tissue microarrays (TMAs) to investigate the expression of 8 candidate biomarkers (CIP4, PPIL1, ITGAV, AKAP14, MICA, FXYD1, ARPC3 e ABG1) and to evaluate their prognostic potential in patients with invasive ductal breast carcinoma. Among these, ARPC3, PPIL1 and CIP4 showed statistically significant associations with cancer specific survival and/or the patient's probability to develop metastasis. We found that increased expression of CIP4 in tumors is associated with a higher probability of developing metastasis. CIP4 is an adaptor protein described in the literature as a modulator of cell migration and invasion and therefore we selected this candidate for detailed functional characterization. We observed that CIP4 expression is increased in tumor cell lines with invasive characteristics. Following the stable and regulated knockdown of CIP4 in the metastatic line MDA-MB-231, we determined that it modulates positively the activation of MAPK-p38 and the expression of MMP2, suggesting that CIP4 participates in important signaling pathways required for the epithelial mesenchymal transition (EMT). CIP4 silencing resulted in an approximate 50% reduction of the migratory and invasive capacity of tumor cells in vitro and decreased the generation of lung metastases in vivo. Collectively, our results indicate that CIP4 has potential as a prognostic marker as well as a potential therapeutic target to control the metastatic dissemination of breast tumors

Utilização de brocas trefina para a confecção de tissue microarray / Use of trephine drills for the production of tissue microarray

Objetivos: Descrever e validar uma técnica alternativa econômica e eficiente para a confecção de amostras teciduais com arranjo matricial (tissue microarrays, TMA). Materiais e métodos: Utilizou-se um motor, um micromotor, um contra-ângulo redutor 16:1 e brocas trefina de aço inoxidável para osso. Análise histomorfométrica do volume das células acinares de glândulas parótidas foi realizada. Para testar marcadores imunoistoquímicos para células mioepiteliais, acinares e ductais das parótidas foram utilizados calponina e PCNA. Resultados: Na análise macroscópica e microscópica das lâminas, não foi encontrada perda total do tissue e nem mesmo deslocamento (parcial e/ou total) deste, sendo as perdas teciduais observadas apenas parciais. Das 90 lâminas analisadas, 59 (65%) obtiveram de 50% a 100% do tissue com ausência de artefato, deslocamento ou perda de tecido. Conclusão: O equipamento proposto pelos autores para a confecção deamostras teciduais com arranjo matricial representa uma alternativa econômica e eficiente.

Objectives: To describe and validate an inexpensive and efficient alternative for the production of tissue microarrays (TMA). Materials and methods: An electric-motor, a hand-piece, a reducing contra-angle hand-piece 16:1 and trephine stainless steel drills for bones were used in this study. A histomorphometric assessment of the volume of the acinar cells of parotid glands was performed. Calponin and PCNA were used to test the immunohistochemical markers for myoepithelial, acinar and ductal cells of parotid glands. Results: During the macroscopic and microscopic analysis, total loss of sections was not observed in any slide as well as artifactual ungluing (total and/or partial) of the sections. The loss of sections was partial. Fifty nine (65%) out of 90 slides showed 50%-100% of the tissue without technical artifact, artifactual ungluing or loss of the section. Conclusion: The equipment proposed by the authors for the production of arrays represents an inexpensive and efficient alternative.

Perda de amostras em tissue microarray: comparação entre técnicas com uso de fita adesiva comercial, lâminas silanizadas pelo método tradicional ou por método modificado / Loss of tissue samples in the tissue microarray: comparison between techniques using commercial adhesive tape, silane-coated microslides by the conventional method and by a modified technique

Introdução/objetivo: O microarranjo tecidual, ou tissue microarray (TMA), permite avaliar múltiplas amostrasde tecido em um único bloco. Um dos problemas do TMA é o descolamento dos cortes teciduais, por isso, para reduzir essa perda, tem-se utilizado fita adesiva especial comercial. Não há relatos comparando o uso dessas fitas adesivas com a técnica de silanização modificada. O objetivo desse estudo foi comparar as perdas de cortes entre lâminas usando fitas adesivas comerciais, lâminas silanizadas por técnica convencional elâminas silanizadas por técnica modificada, com menor consumo de acetona. Material e método: O TMA foiconstruído com blocos de tecido hepático, em dispositivo de base fixa, colocando-se 32 cilindros de 2 mmde diâmetro em duplicata e espaçamento de 2,2 mm. Quinze secções de 4 μm foram colocadas em lâminas silanizadas a 4% por técnica convencional (grupo 1), 15 em lâminas silanizadas com técnica modificada (6%de silano e com uso mínimo de acetona) (grupo 2) e 15 em lâminas com fita adesiva comercial de acordo comas recomendações do fabricante (grupo 3). Todas as lâminas foram processadas por imuno-histoquímica para citoqueratina 18, com recuperação antigênica em tampão citrato pH 6, em microondas. As perdas de amostrasforam quantificadas e expressas como: perda total (≥ 80%), quase total (75% a 79%) ou parcial (50% a 74%).Resultados: A perda de tecidos foi semelhante nos três grupos: com silanização tradicional, modificada oufita adesiva comercial (4,9 vs. 3,1 vs. 8,1, respectivamente) (análise de variância [ANOVA], p = 0,3654). Umadas lâminas com a fita adesiva apresentou descolamento artefatual de todos os tecidos e outra de 20 tecidosem um dos lados. Nenhuma das lâminas silanizadas apresentou tal artefato. Conclusão: Lâminas silanizadas têm resultados satisfatórios, requerem menos treinamento técnico e reduzem os custos da utilização do TMA justificando seu uso em pesquisa...

Introduction/objective: The tissue microarray (TMA) technique allows the evaluation of multiple tissue samplesin a single block. One of the problems of TMA is the ungluing of tissue sections, thus commercial adhesive tape has been used to reduce this loss. There are no reports comparing the use of the commercial adhesive tape with the use of the modified silane-coated technique. The objective of this study was to compare section loss in slides using commercial adhesive tape, silane-coated microslides with the conventional technique or with the modified technique. Material and method: The TMA was constructed with hepatic tissue blocks embedded in paraffin, using a fixed base device, placing 32 cylinders of 2 mm in diameter in duplicate and 2.2 mm apart from each other. Fifteen 4-μm sections were placed on conventional silane-coated microslides at 4% (Group 1), 15 on silane-coated microslides with a modified technique (6% of silane and minimum use of acetone) (Group 2), and 15 on slides using commercial adhesive tape, according to the manufacturer's recommendations (Group 3). All microslides were processed by immunohistochemistry for cytokeratin 18, with antigen retrieval accomplished by incubation with citrate buffer pH 6.0 with microwave enhancement. Samples loss was quantified and expressed as: total (≥ 80%), almost complete (75% to 79%) or partial (50% to 74%). Results: The loss of sections was similar in all three groups (4.9 vs. 3.1 vs. 8.1, respectively) (analysis of variance [ANOVA], p = 0.3654). One slide usingcommercial adhesive tape showed artifactual ungluing of all sections and another one showed loss of 20 sampleson one side of the slide. None of the silane-coated microslides showed such artifact. Conclusions: Silane-coated microslides show adequate results, require less technical training and reduce the cost of TMA procedure, whatjustifies their use in research...